NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-031-SSA1-1993, BIENES Y SERVICIOS. PRODUCTOS DE LA PESCA. MOLUSCOS BIVALVOS FRESCOS-REFRIGERADOS Y CONGELADOS. ESPECIFICACIONES SANITARIAS.

Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de Salud.

JOSE MELJEM MOCTEZUMA, Director General de Control Sanitario de Bienes y Servicios, por acuerdo del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, con fundamento en los artículos 39 de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federal; 38 fracción II, 47 de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 8o. fracción IV y 13 fracción I del Reglamento Interior de la Secretaría de Salud.

PREFACIO

En la elaboración de la presente Norma participaron los siguientes organismos e instituciones:

SECRETARIA DE SALUD

SECRETARIA DE PESCA

INSTITUTO NACIONAL DE LA PESCA

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO

CAMARA NACIONAL DE LA INDUSTRIA PESQUERA

INDICE

0. INTRODUCCION
1. OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACION
2. REFERENCIAS
3. DEFINICIONES
4. SIMBOLOS Y ABREVIATURAS
5. CLASIFICACION
6. ESPECIFICACIONES SANITARIAS
7. MUESTREO
8. METODOS DE PRUEBA
9. ETIQUETADO
10. ENVASE, EMPAQUE Y EMBALAJE
11. CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES
12. BIBLIOGRAFIA
13. OBSERVANCIA DE LA NORMA
14. VIGENCIA
15. APENDICE NORMATIVO
Apéndice A

0. Introducción

Las enfermedades transmitidas por alimentos, en su mayoría son de tipo infeccioso y de origen químico como las intoxicaciones. La incidencia de estas enfermedades sigue constituyendo uno de los problemas de salud pública más extendidos en el mundo contempóraneo y permanecen como una de las causas principales de morbilidad, que ocupan el segundo lugar entre las enfermedades transmisibles de notificación obligatoria.

Entre los alimentos involucrados resaltan los moluscos bivalvos, debido a que estos productos en su origen están sometidos a una contaminación microbiológica y química, entre otras, lo que aunado a la forma de consumo generan enfermedades para el consumidor.

Una Norma Oficial Mexicana, que regule a estos productos desde el punto de vista sanitario, permitirá promover el consumo de los mismos y a la vez proteger la salud del consumidor.

1. Objetivo y campo de aplicación

1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece las especificaciones sanitarias de los moluscos bivalvos frescos-refrigerados y congelados.

1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas físicas o morales que se dedican a su proceso o importación.

2. Referencias

Esta Norma se complementa con lo siguiente:

NOM-051-SCFI-1994 Especificaciones generales de etiquetado para alimentos y bebidas no alcohólicas preenvasados.

NOM-087-SSA1-1994 Aves frescas refrigeradas y congeladas, enteras y troceadas envasadas. Especificaciones sanitarias. *

NOM-092-SSA1-1994 Método para la cuenta de bacterias aeróbicas en placa. *

NOM-110-SSA1-1994 Preparación y dilución de muestras para su análisis microbiológico. *

NOM-112-SSA1-1994 Determinación de bacterias coliformes. Técnica del número más probable. *

NOM-114-SSA1-1994 Método para la determinación de Salmonella. *

NOM-117-SSA1-1994 Método de prueba para la determinación de cadmio, arsénico, plomo, estaño, cobre, fierro, zinc y mercurio en alimentos, agua potable y agua purificada por absorción atómica. *

NOM-120-SSA1-1994 Buenas prácticas de higiene y sanidad en bienes y servicios. *

NOM-128-SSA1-1994 Que establece la aplicación de un sistema de análisis de riesgos y control de puntos críticos en la planta industrial procesadora de productos de la pesca. *

* Proyecto en proceso de expedición como Norma Oficial Mexicana.

3. Definiciones

Para fines de esta Norma se entiende por:

3.1 Almeja, molusco bivalvo que vive libre, fijo o semifijo, sobre o dentro del fondo de las aguas marinas, estuarinas o dulces con nula, escasa o regular movilidad con o sin pie; con o sin músculo aductor anterior, casi siempre sifón y con concha generalmente rugosa, gruesa y dura.

3.2 Biotoxinas marinas, compuestos venenosos producidos por los dinoflagelados (Ptychodiscus brevis, Gonyaulax spp, Gambierdiscus toxicus, Pyrodinium bahamensis, Dinophisis spp), y las Diatomeas del género Nitzchia; que son acumuladas en los organismos que se alimentan de estos protozoarios.

3.3 Congelación, método de conservación físico que se efectúa por medio de equipo especial para lograr una reducción de la temperatura de los productos objeto de esta Norma en su centro térmico a máximo -18 ºC (255 K), reduciendo los cambios enzimáticos y microbiológicos.

3.4 Enhielado, método de conservación físico con el cual se mantiene la temperatura interna del producto a máximo 4ºC (277 K) con la utilización de hielo potable.

3.5 Etiqueta, todo rótulo, marbete, inscripción, imagen u otra forma descriptiva y gráfica, ya sea que esté impreso, marcado, grabado, en relieve, hueco, estarcido o adherido al empaque o envase del producto.

3.6 Fecha de caducidad, fecha límite en que se considera que un producto preenvasado almacenado en las condiciones sugeridas por el fabricante, reduce o elimina las características sanitarias que debe reunir para su consumo. Después de esta fecha no debe comercializarse ni consumirse.

3.7 Límite máximo, concentración permitida de aditivos, microorganismos, parásitos, materia extraña, plaguicidas, biotoxinas, residuos de medicamentos y metales pesados y metaloides de un alimento, bebida o materia prima.

3.8 Lote, cantidad de un producto elaborado en un solo proceso con el equipo y sustancias requeridas, en un mismo lapso para garantizar su homogeneidad. Por lo tanto, no puede ser mayor que la capacidad del equipo ni integrarse con partidas hechas en varios periodos.

3.9 Marea roja, un tipo de contaminación natural producida por protozoarios dinoflagelados de varias especies, que producen biotoxinas marinas.

3.10 Materia extraña, toda aquella sustancia, resto o desecho orgánico o no que se presenta en el producto sea por contaminación o por manejo poco higiénico del mismo durante su elaboración, considerándose entre otros: pelos, excretas de cualquier especie, fragmentos de hueso e insectos que resultan perjudiciales para la salud.

3.11 Mejillón, molusco bivalvo que vive fijo sobre el fondo de las aguas marinas o estuarinas, formando racimos adheridos por filamentos bisales a casi cualquier sustrato, con pie y músculo aductor anterior muy reducido; con concha lisa, delgada y frágil.

3.12 Metal pesado, aquel de peso atómico mayor que el del sodio (22,9) que forma jabones al reaccionar con ácidos grasos. Ejemplos: aluminio, plomo y cobalto.

3.13 Métodos de prueba, procedimientos analíticos utilizados en el laboratorio para comprobar que un producto satisface las especificaciones que establece la Norma.

3.14 Molusco bivalvo, organismo acuático comestible que proviene de agua dulce, salobre o salada; de cuerpo blando y cubierto por una concha compuesta invariablemente por dos valvas, el cual se alimenta por filtración.

3.15 Molusco bivalvo en su concha, organismo vivo que se define en 3.14 y que conserva su concha después de ser recolectado en las áreas de producción aprobadas, o bien de acuacultura, durante su desarrollo natural.

3.16 Molusco bivalvo desconchado comestible, el organismo a que se refiere en 3.14, que le ha sido retirada la concha, lavado y clasificado antes de su venta.

3.17 Molusco bivalvo fresco-refrigerado, organismo definido en 3.14, cuyo tratamiento de conservación es la refrigeración y el enhielado para mantener sus características sensoriales.

3.18 Molusco bivalvo congelado, el organismo definido en 3.14 y desconchado que se conserva a temperatura de congelación.

3.19 Muestra, número total de unidades de producto provenientes de un lote que representan las características y condiciones del mismo; de forma que los resultados obtenidos representen los del lote.

3.20 Ostión u ostra, molusco bivalvo que vive fijo sobre el fondo de las aguas marinas o estuarinas, adheridos algunos por filamentos bisales y otros por cementación de una de las valvas a casi cualquier sustrato presente, que están carentes de pie y músculo aductor anterior y que la concha posee en su parte externa una textura extremadamente rugosa con conformación de capas superpuestas, además de ser relativamente frágil.

3.21 Plaguicidas, sustancia o mezcla de sustancias utilizadas para prevenir, destruir, repeler o mitigar cualquier forma de vida que sea nociva para la salud, los bienes del hombre o el ambiente, excepto la que exista sobre o dentro del ser humano y los protozoarios, virus, bacterias, hongos u otros microorganismos similares sobre o dentro de los animales.

3.22 Proceso, conjunto de actividades relativas a la obtención, elaboración, fabricación, preparación, conservación, mezclado, acondicionamiento, envasado, manipulación, transporte, distribución, almacenamiento y expendio a suministro al público de productos.

3.23 Refrigeración, método de conservación físico con el cual se mantiene la temperatura interna de un producto a máximo 4 ºC (277 K).

4. Símbolos y abreviaturas

Cuando en esta Norma se haga referencia a los siguientes símbolos y abreviaturas se entiende por:

ºC grados Celsius

K grados Kelvin

kg kilogramo

ml mililitros

UR unidad ratón

µg microgramos

UFC unidades formadoras de colonias

g gramos

NMP número más probable

mg miligramo

/ por

Cuando en la presente Norma se mencione al:

Reglamento, debe entenderse que se trata del Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios.

5. Clasificación

Los productos objeto de esta Norma por su proceso se clasifican en:

5.1 Moluscos bivalvos frescos-refrigerados

5.2 Moluscos bivalvos congelados

6. Especificaciones sanitarias

Los productos objeto de este ordenamiento deben cumplir las siguientes especificaciones:

6.1 Físicas

6.1.1 Materia extraña

Los moluscos bivalvos frescos-refrigerados y congelados deben estar exentos de materia extraña.

6.2 Químicas

ESPECIFICACIONES LIMITE MAXIMO

pH del líquido intervalvar 7,0-7,25

pH de la carne 6,0-6,5

Nitrógeno amoniacal en 100 g 30 mg

6.3 Contaminación por biotoxinas marinas

ESPECIFICACIONES LIMITE MAXIMO

Toxinas de Ptychodiscus brevis 20 UR/100g en carne

Saxitoxina, veneno paralizante

de moluscos 80 µg/100g en carne

Acido domoico 20 µg/g en carne

6.4 Microbiológicas

ESPECIFICACIONES LIMITE MAXIMO

Mesofílicos aerobios 500 000 UFC/g

Bacterias coliformes fecales (230 NMP/100 g en carne

más líquido intervalvar

Salmonella spp en 25 g Ausente

Vibrio cholerae 0 1 Ausente

toxigénico en 50 g

6.5 Contaminación por metales pesados

ESPECIFICACIONES LIMITE MAXIMO

(mg/kg)

Mercurio (Hg) 1,0

Mercurio como metil mercurio* 0,5

Plomo (Pb) 1,0

Cadmio (Cd) 0,5

* Es necesario únicamente en los casos en que el mercurio total supere el nivel de referencia establecido, con la finalidad de aceptar o rechazar el lote.

6.6 Contaminación por plaguicidas

Los moluscos bivalvos frescos-refrigerados y congelados objeto de esta Norma no deben contener residuos de plaguicidas como: Aldrin, Dieldrin, Endrin, Heptacloro, Kapone u otros prohibidos en el Catálogo de Plaguicidas publicado en el Diario Oficial de la Federación.

6.7 Clasificación de Areas

Para efectos de esta Norma las áreas se clasifican en:

6.7.1 Area aprobada, aquella que cumple con las especificaciones siguientes:

MICROORGANISMOS LIMITE MAXIMO

Bacterias coliformes La mediana o el promedio geométrico del

totales NMP de bacterias coliformes en el agua, no debe exceder de 70 NMP/100 ml; no más del 10% de las muestras debe exceder a 230 NMP/100 ml de la prueba de dilución decimal en 5 tubos o 330 NMP/100 ml cuando se utiliza la prueba de dilución decimal de 3 tubos.

Bacterias coliformes La mediana o el promedio geométrico del

fecales NMP del agua no excederá de 14 NMP/100 ml y no más del 10% de las muestras excederá de 43 NMP/100 ml para la prueba de dilución decimal de 5 tubos con tres diluciones o 49 NMP/100 ml para la prueba de dilución decimal de 3 tubos.

6.7.2 Area aprobada condicionalmente, aquella que cumple con las especificaciones microbiológicas de acuerdo a los siguientes criterios:

Las áreas de producción que están sujetas a contaminación microbiológica intermitente, son las que se pueden clasificar como aprobadas condicionalmente; esta alternativa se puede utilizar cuando existe interés sobre un área que esté afectada por eventos de contaminación predecibles en tiempo y la cosecha de moluscos bivalvos sea destinada a venta directa en determinadas épocas del año. Así también la calidad sanitaria del área puede estar afectada por poblaciones estacionales, fuentes de contaminación no puntuales o por el uso esporádico de muelles o de puertos.

Por lo anterior el área debe estar sujeta a un programa de manejo que contenga los siguientes puntos:

6.7.2.1 Evaluación de fuentes potenciales de contaminación en términos de sus efectos en el agua y en el área.

Monitoreo rutinario.

6.7.2.2 Disponibilidad de instalaciones y condiciones de operación para el tratamiento de aguas residuales descargadas directa o indirectamente por el efluente en el área.

6.7.2.3 Condiciones para la apertura o clausura. Esta área está sujeta a reaperturas o clausuras, las cuales están determinadas por los resultados de los análisis bacteriológicos establecidos para un área aprobada y prohibida respectivamente.

6.7.3 Area restringida, la que cumple con las especificaciones microbiológicas siguientes:

MICROORGANISMOS MAXIMO

Bacterias coliformes La mediana de coliformes totales o del

totales promedio geométrico del NMP de las muestras de aguas, no debe exceder de 700 NMP/100 ml y no más del 10% de las muestras excederá de 2,300 NMP/100 ml para la prueba de dilución decimal de 5 tubos o 3,300 NMP/100 ml para la prueba de dilución decimal de 3 tubos.

Bacterias coliformes La mediana de coliformes fecales

fecales promedio geométrico del NMP del agua no debe exceder de 88 NMP/100 ml y no más del 10% excederá de 260 NMP/100 ml para la prueba de dilución decimal de 5 tubos o 300 NMP/100 ml para la prueba de dilución decimal de 3 tubos.

6.7.4 Area prohibida, aquella en la cual la calidad del agua rebase los límites máximos que representen un riesgo para la salud del consumidor en los siguientes casos:

6.7.4.1 Que estén contaminadas con aguas residuales, domésticas, municipales, industriales, agrícolas, de embarcaciones, plataformas u otras instalaciones lacustres o marítimas;

6.7.4.2 Que estén afectadas por derrames de materiales que contengan sustancias tóxicas como consecuencia de contingencias;

6.7.4.3 Que estén afectadas por residuos de material radiactivo;

6.7.4.4 Que estén afectadas por biotoxinas naturales, y

6.7.4.5 Que estén contaminadas por otras fuentes no contempladas en esta Norma.

7. Muestreo

El procedimiento de muestreo para los productos objeto de esta Norma debe sujetarse a lo que establece la Ley General de Salud.

8. Métodos de prueba

Para la verificación de las especificaciones químicas y microbiológicas que se establecen en esta Norma se deben aplicar los métodos de prueba señalados en el apartado de referencias. Para la determinación de:

Vibrio cholerae, se debe aplicar el método establecido en el apéndice normativo A de este ordenamiento.

pH y nitrógeno amoniacal, se deben efectuar con los métodos contemplados en el apéndice normativo de la NOM-087-SSA1-1994. Aves frescas refrigeradas y congeladas. Enteras y troceadas. Especificaciones sanitarias.

9. Etiquetado

La etiqueta de los productos objeto de esta Norma, además de cumplir con lo establecido en el Reglamento y la Norma Oficial Mexicana correspondiente, debe sujetarse a lo siguiente:

Si el producto está refrigerado, el texto: "Manténgase en refrigeración de 2ºC a 4ºC".

Si el producto está congelado, el texto: "Consérvese en congelación a -18ºC o a una temperatura inferior". "Una vez descongelado no debe volverse a congelar".

Se debe indicar en los productos frescos refrigerados o congelados la fecha de extracción, el área de producción y el número del Certificado de Exportación e Importación del producto, el número de lote, día, mes y año de la elaboración y la fecha de caducidad, señalando día, mes y año.

10. Envase, empaque y embalaje

10.1 Envase

Los productos objeto de esta Norma se deben envasar en recipientes de tipo sanitario, elaborados con materiales inocuos y resistentes a distintas etapas del proceso, de tal manera que no reaccionen con el producto o alteren sus características físicas, químicas y organolépticas.

10.2 Empaque

Se deben usar envolturas de material resistente que ofrezcan la protección adecuada a los envases para impedir su deterioro exterior a la vez que faciliten su manipulación, almacenamiento y distribución.

10.3 Embalaje

Se deben usar cajas o envolturas de material resistente que ofrezcan la protección adecuada a los envases para impedir su deterioro exterior, a la vez que faciliten su manipulación, almacenamiento y distribución.

11. Concordancia con normas internacionales

Esta Norma no tiene concordancia con normas internacionales.

12. Bibliografía

12.1. Secretaría de Comercio y Fomento Industrial. 1992. Ley Federal sobre Metrología y Normalización. Diario Oficial de la Federación. México, D.F.

12.2 Secretaría de Salud. 1984. Ley General de Salud. Diario Oficial de la Federación. México, D.F.

12.3 Secretaría de Salud. 1988. Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios. Diario Oficial de la Federación. México, D.F.

12.4 Programa Mexicano de Sanidad de Moluscos Bivalvos. 1989. "Manual de Operación I del Control Sanitario de Areas de Producción de Moluscos Bivalvos. México, D.F.

12.5 Programa Mexicano de Sanidad de Moluscos Bivalvos. 1989. "Manual de Operación II de los Aspectos Sanitarios de la Cosecha, Procesamiento y Distribución de los Moluscos Bivalvos. México, D.F.

12.6 Secretaría de Desarrollo Social. Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección del Ambiente.

12.7 Secretaría de Salud - Laboratorio Nacional de Salud Pública. 1992. Manual de Técnicas y Procedimientos para la Investigación de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. México, D.F.

12.8 Secretaría de Salud. 1992. Manual de Técnicas y Procedimientos para la Investigación del Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. Laboratorio Nacional de Salud Pública. México, D.F.

12.9 Association of Official Analytical Chemist. 1990. Official Methods of Analysis. "Fish and Other Marine Products". Ed Kenneth Helrich. Virginia, USA.

12.10 Code of Federal Regulations. 1991. "Regulations Governing Processed Fishery Products and U.S Standars for Grades of Fishery Products. Revised as of october 1".

12.11 Comisión del Codex Alimentarius. 1978. "Código Internacional recomendado de Prácticas de Higiene para mariscos moluscoides"; CAC/RCP 18. Roma, Italia.

12.12 World Health Organization. 1989. "International Consultive Group on Food Irradiation Consultation on Microbiological Criteria, for Food to be Forther Proccesed Including by Irradiation; 29 may - 2 june. Geneve.

13. Observancia de la Norma

La vigilancia en el cumplimiento de la presente Norma corresponde a la Secretaría de Salud.

14. Vigencia

La presente Norma Oficial Mexicana entrará en vigor con su carácter obligatorio a los trescientos sesenta y cinco días siguientes a partir de su publicación en el Diario Oficial de la Federación.

Sufragio Efectivo. No Reelección.

México, D.F., a 29 de noviembre de 1994.- El Director General de Control Sanitario de Bienes y Servicios, José Meljem Moctezuma.- Rúbrica.

Apéndice Normativo A

DE LOS METODOS DE PRUEBA

1. Procedimiento de Bioensayo para Toxina Paralizante en Moluscos Bivalvos.

(Precaución: Use guantes de hule, cuando manipule materiales que puedan contener toxina paralizante de los moluscos).

1.1 Materiales

a) Solución estándar de saxitoxina (100 µg/ml)

b) Solución de referencia de saxitoxina (1 µg/ml)

Preparar la solución de referencia de veneno paralizante ( 1 µg de saxitoxina/ml) tomando 1,0 ml de solución estándar en matraz volumétrico de 100 ml, llevar al volumen con agua destilada acidificada con HCl (pH=3). Esta solución es estable por varias semanas si se guarda a 3 o 4 ºC y el pH está entre 2,0 y 4,0.

c) Ratones, emplear ratones machos albinos, sanos, cepa Webster Suiza, con un peso de 19 a 21 gramos. Los animales que pesan de 17 a 19 y de 21 a 23 gramos también pueden ser utilizados en ausencia de animales con el rango de peso deseado. No reusar ratones sobrevivientes.

1.2 Estandarización de bioensayo

Diluir alícuotas de 10 ml de la solución de referencia con 10, 15, 20, 25 y 30 ml de agua, respectivamente. Posteriormente inyectar 1 ml de cada dilución por vía intraperitoneal a unos cuantos ratones de prueba. La mediana del tiempo de muerte debe estar entre 5 y 7 minutos, el pH de las diluciones debe estar entre 2 y 4, en ningún caso debe ser mayor a 4,5.

Probar diluciones adicionales con incrementos de 1 ml de agua destilada. Por ejemplo, si la alícuota de 10 ml diluidos con 25 ml de agua mata a los ratones en 5 a 7 minutos, preparar soluciones 10 + 24 y 10 + 26.

Inyectar a un grupo de 10 ratones con 2 diluciones (de preferencia 3) que estén dentro del tiempo entre 5 a 7 minutos. Aplicando dosis de 1 ml por vía intraperitoneal a cada ratón. Registrar el tiempo de inyección y de muerte lo más aproximado posible a intervalos de 5 segundos, si se registran 7 segundos, redondear a 5 segundos y si se registran 8 segundos redondear a 10 segundos. El tiempo de muerte es el tiempo transcurrrido entre el término de la inyección y el último jadeo del ratón.

Pesar y anotar el peso de los 10 ratones, aproximando hasta 0,5 gramos e inyectar cada uno con un ml de 2 o 3 diluciones de preferencia que provoquen la muerte en una mediana de tiempo de 5 a 7 minutos. Anotar los tiempos de muerte. Si más ratones de un grupo de 10 sobrevive a la inyección de una dilución particular de la solución de referencia, repetir la inyección en un nuevo grupo de 10 ratones. Antes de proceder a realizar la prueba. Con el segundo grupo, investigar las variables de procedimiento que pudieron haber provocado los resultados iniciales tales como filtración, derrame de la mezcla inyectada en el ratón o el no haber inyectado el volumen completo de la solución estándar.

1.2.1 Cálculos

Determinar la mediana del tiempo de muerte para cada grupo de 10 ratones usados con cada dilución. Descartar los resultados para cada grupo de 10 ratones que den una mediana de muerte menor de 5 o mayor de 7 minutos, si cualquier grupo de 10 ratones da una mediana de tiempo de muerte en el intervalo de tiempo mencionado, incluir todos los grupos de 10 ratones usados para que los cálculos de la dilución subsecuente o algunas muertes caigan en el rango deseado.

Usar los tiempos de muerte por cada ratón para cada grupo, en el cual la mediana de tiempo de muerte quede entre 5 y 7 minutos, determinar las Unidades Ratón correspondientes a partir de la tabla de Sommer's. Con el peso de cada ratón se determinará el factor de corrección en la tabla de correcciones de pesos de ratones. Multiplicar las Unidades Ratón por el factor de conversión del peso para determinar los valores para las Unidades Ratón corregidas por ml de diluciones seleccionadas, dividir los µg de toxina/ml calculados en las diluciones seleccionadas por las URC asociadas, para obtener el factor de conversión (FC). Calcular el promedio de FC individuales, el valor resultante es útil para verificar los ensayos de rutina, este valor representa los microgramos de veneno equivalentes a una UR.

Los valores individuales del FC obtenidos en el laboratorio, pueden variar significativamente si no existe un control absoluto de la técnica. Por lo regular el uso de estándares de referencia o estándares secundarios, depende del volumen de ejecución del trabajo de ensayo.

1.2.2 Uso de estándares en el ensayo de rutina de moluscos bivalvos

Verificar los valores del FC periódicamente como sigue: Si los moluscos son analizados menos de una vez a la semana, determinar el valor del FC cada día que el ensayo sea ejecutado, inocular 5 ratones con una dilución apropiada de la solución estándar. Si los ensayos se realizan durante varios días a la semana, verificar solamente una vez por semana la dilución cuya mediana de tiempo de muerte cae entre 5-7 minutos. El FC así determinando deberá quedar dentro de ±20% del FC estándar predeterminado.

Si los resultados no concuerdan, verificar el FC sobre una base de 10 ratones formado por la adición de 5 ratones inoculados con la misma dilución de solución estándar de saxitoxina e incluir los resultados a los 5 ratones originales. Inocular un segundo grupo de 10 ratones. El promedio de valores del FC obtenidos de los 6 grupos de 10 ratones representan un nuevo valor de FC.

Repetir la verificación de los valores de FC de manera que los resultados sean consistentes dentro del ±20%. Si se encuentran grandes variaciones, investigar la posibilidad de controlar y reconocer otras variables que afectan al método antes de proceder con los análisis de rutina.

1.3 Preparación de la muestra

a) Almejas, ostiones y mejillones.- Lavar los moluscos bivalvos con agua potable retirando la arena y cualquier material extraño. Desconchar la carne con cuidado, sin lesionar el cuerpo del molusco. Colectar aproximadamente 150 gramos de carne sobre un tamiz del número 10 y dejar escurrir durante 5 minutos. Descartar las conchas, moler la carne en una mezcladora o licuadora hasta la homogenización.

b) Escalopas.- Separar la porción comestible (músculo aductor) y solamente aplicar la prueba para esta porción sola. Drenar y moler como en (a).

1.3.1 Extracción de PSP

Pesar 100 gramos de carne homogeneizada en un vaso de precipitado tarado.

Agregar 100 ml de solución de ácido clorhídrico (HCl) 0,18 N, agitar y verificar, el pH deberá estar entre 2 y 4, de preferencia 3.

Calentar la mezcla, hervir 5 minutos y dejar enfriar a la temperatura ambiente. Ajustar la mezcla enfriada a un pH 2,0-4,0 (nunca mayor a 4,5), verificar el pH con indicador universal BDH, azul de fenol, papel rojo congo o con un potenciómetro. Para bajar el pH agregar HCl 5 N por goteo, agitando constantemente para evitar la alcalinización local y la consiguiente destrucción de la toxina.

Transferir la mezcla a una probeta graduada y diluir a 200 ml.

Regresar la mezcla a un vaso de precipitado, agitar para homogeneizar y dejar reposar hasta que una parte del sobrenadante sea translúcido y pueda encontrarse libre de partículas sólidas capaces de "tapar" una aguja hipodérmica del 26. Si es necesario centrifugar el sobrenadante 5 minutos a 3000 rpm o filtrar por papel. Filtrar sólo la cantidad de líquido necesario para el bioensayo.

1.4 Prueba de bioensayo en ratón

Pesar 3 ratones, anotando el peso para cada muestra que va a ser analizada. Inyectar por vía intraperitoneal cada ratón con l ml de extracto centrifugado. Este es el punto crítico del bioensayo. Si las inyecciones no se hacen directamente en la cavidad peritoneal el tiempo de muerte no es reproducible.

Descartar cualquier ratón en donde se pierda o se filtre más de una gota de extracto. Activar el cronómetro en el momento de la inyección y mantener la observación cuidadosamente hasta el tiempo de muerte, que se manifiesta por el último jadeo del animal. Registrar el momento de la muerte de cada ratón, si la mediana de tiempo de muerte es de 5 minutos, diluir el extracto con HCl 0,01 N, e inyectar otro lote de ratones hasta obtener los tiempos de muerte entre 5 y 7 minutos. Si la mediana del tiempo de muerte con el extracto no diluido es mayor de 7 minutos, el dato puede ser utilizado para determinar la toxicidad de la muestra.

1.4.1 Cálculo de la concentración de PSP

(µg/100g de carne de molusco)

Determinar la UR/ml de extracto que corresponde a los tiempos de muerte observados de la tabla de corrección de pesos de ratones.

Calcular las URC, multiplicando las UR correspondientes al tiempo de muerte de cada ratón por el factor de corrección del peso obtenido en la tabla de corrección de pesos de ratones.

Usar la mediana de los URC/ml de los tres bioensayos para determinar µg de veneno/100g de carne de molusco, de acuerdo con la siguiente ecuación:

µg PSP/100g carne de molusco = Mediana URC/ml x FC x FD x 200

En donde:

FC = Factor de conversión

FD = Factor de dilución

Ejemplo: PSP = 1,60 x 0,20 x 1 x 200

PSP = 64 µg/100g

Cualquier valor más grande que 80 µg/100g, es considerado valor de riesgo y el molusco debe ser prohibido para consumo humano.

Tabla de corrección de pesos de ratones.

Peso del ratón(g) Unidades ratón
10
10.5
11
11.5
12
12.5
13
13.5
14
14.5
15
15.5
16
16.5
17
17.5
18
18.5
19
19.5
20
20.5
21
21.5
22
22.5
23		 0.50
0.53
0.56
0.59
0.62
0.65
0.675
0.70
0.73
0.76
0.785
0.81
0.84
0.86
0.88
0.905
0.93
0.95
0.97
0.985
1.000
1.015
1.03
1.04
1.05
1.06
1.07

TABLA DE SOMMER'S.

Tiempo de muerte: relación unidades ratón para toxina paralizante de moluscos. (ácida)

Tiempo de Unidades Tiempo de Unidades

Muerte* Ratón Muerte Ratón

1:00 100 5:00 1.92

10 66.2 05 1.89

15 38.3 10 1.86

20 26.4 15 1.83

25 20.7 20 1.80

30 16.5 30 1.74

35 13.9 40 1.69

40 11.9 45 1.67

45 10.4 50 1.64

50 9.33 6:00 1.60

55 8.42 15 1.54

2:00 7.67 30 1.48

05 7.04 45 1.43

10 6.52 7:00 1.39

15 6.06 15 1.35

20 5.66 30 1.31

25 5.32 45 1.28

30 5.00 8:00 1.25

35 4.73 15 1.22

40 4.48 30 1.20

45 4.26 45 1.18

50 4.06 9:00 1.16

55 4.88 30 1.13

3:00 3.70 10:00 1.11

05 3.57 30 1.09

10 3.43 11:00 1.075

15 3.31 30 1.06

20 3.19 12:00 1.05

25 3.08 13 1.03

30 2.98 14 1.015

35 2.88 15 1.000

40 2.79 16 0.99

45 2.71 17 0.98

50 2.63 18 0.972

55 2.56 19 0.965

4:00 2.50 20 0.96

05 2.44 21 0.954

10 2.38 22 0.948

15 2.32 23 0.942

20 2.26 24 0.937

25 2.21 25 0.934

30 2.16 30 0.917

35 2.12 40 0.898

40 2.08 60 0.875

45 2.04

50 2.00

55 1.96

2.22

*Minutos: segundos

2. Técnicas y Procedimientos para la Investigación de Vibrio cholerae

2.1 Material y equipo

2.2 Medios de cultivo

Agua Peptonada Alcalina (APW)

Agar Tiosulfato, Citrato, Sales Biliares y Sacarosa (TCBS)

Agar modificado con Celobiosa, Polimixina B y Colistina (mCPC)

SOLUCION STOCK DE COLORANTES 1 000 X:

SOLUCION 2:

Agar T1N1 (Agar Triptona y Sal)

Agar Gelatina (GA)

Agar Gelatina con Sal (GS)

Caldo Glucosa de Hugh-Leifson

Medio Base de Descarboxilasa (Arginina, Lisina y Ornitina)

Caldo Triptona y Caldos Triptona Sal T1N0,T1N1,T1N3, T1N6,T1N8 y T1N10

Caldo Soya Tripticasa (TSB)

Agar Soya Tripticasa (TSA)

Agar de Hierro Kligler (KIA)

Agar Arginina Glucosa Inclinado (AGS)

Agar Triple Azúcar y Hierro (TSI)

Agar de Hierro y Lisina (LIA)

Caldo Rojo de Metilo y Vogues Proskauer(RM-VP)

Medio para prueba de movilidad (semisólida)

2.2.1 Soluciones y reactivos

Prueba de rojo de metilo.

Prueba de Vogues-Proskauer.

Prueba de oxidasa.

Reacción de indol.

2.3 Procedimiento:

Sembrar un tubo con 5 ml de caldo triptona. Incubar 48 horas a 35ºC. Agregar de 0,2 a 0,3 ml del reactivo. El desarrollo de un color intenso constituye una prueba Positiva para indol.

Toma de muestra

La toma de muestra para análisis microbiológicos se deberá hacer en condiciones asépticas y en recipientes estériles.

2.4 Preparación de la muestra

Las muestras de moluscos bivalvos deberán analizarse en su composición básica de líquido y carne.

Para moluscos bivalvos desconchar de 10 a 12 piezas grandes, incluir el líquido. Verter 50 g en 450 ml de agua peptonada alcalina (APW), licue para homogeneizar durante 2 minutos a alta velocidad. Esta es la dilución 1:10. Colocar 250 g de esta dilución en un segundo recipiente estéril. Preparar dos series de diluciones 1:100 y 1:1000. En este momento deberá tener dos series de tres diluciones. Incubar una serie a 35-37ºC y la otra a 42ºC.

2.4.1 Resembrar

Después de la incubación, y sin agitar, transferir el inóculo de la película (crecimiento superficial) con un asa de 3-5 mm de diámetro a una placa por lo menos, de cada uno de los medios de cultivo selectivos: Agar con tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa (TCBS) o al agar modificado con celobiosa, polimixina B y colistina (mCPC), la polimixina inhibe al biotipo Clásico de V. cholerae. Incubar el agar TCBS durante 18 a 24 horas de 35-37ºC y el agar mCPC durante 18 a 24 horas de 39-40ºC.

2.5 Morfología colonial.

Examinar las placas a fin de determinar si se presentan las características coloniales que a continuación se describen, seleccionar por lo menos 3 colonias sospechosas de cada placa y aplicarlas con estría cruzada para aislar en agar T1N1 o en agar soya tripticasa con sal (al 2% de concentración de NaCl) e incubar durante 12-18 horas a 35-37°C. Es necesario hacer un cultivo en un medio no selectivo a fin de garantizar la pureza de las colonias, antes de las pruebas bioquímicas, se puede inocular a los agares gelatina (GA) y gelatina sal (GS) en el segundo día. Los resultados serán confiables si las placas de aislamiento muestran colonias puras.

a.- Agar TCBS. Las colonias de V. cholerae (El Tor y Clásico) son grandes, lisas, amarillas (positivas para la fermentación de la sacarosa) y ligeramente achatadas, con el centro opaco y los bordes translúcidos.

Nota: Las especies de vibrio no producen colonias pequeñas de color crema en agar TCBS. Las colonias de V. mimicus, que están estrechamente relacionadas con la especie anterior, son verdes (sacarosa negativas). La mayoría de las demás especies de vibrio crecen en agar TCBS y producen colonias amarillas y verdes.

b.- Agar mCPC. Las colonias de V. cholerae El Tor son púrpuras (negativas para la fermentación de la celobiosa). El V. vulnificus produce colonias amarillas achatadas, con el centro opaco y los bordes translúcidos. La mayoría de las demás especies de vibrio no crecen fácilmente en agar mCPC.

2.6 Diferenciación.

Diferenciación de los vibrios sospechosos de los microorganismos que no son vibrios.

a.- TSI,KIA y agar inclinado de Arginina y Glucosa (AGS). Inocular las colonias individuales en medios de cultivo TSI (Agar de Triple Azúcar y Hierro), KIA (Agar de Hierro Kliger) y AGS, picar y estriar en el agar inclinado. Incubar los tubos inoculados, con el tapón no muy apretado, durante 18 a 24 horas de 35-37ºC. Se recomiendan estos medios porque las reacciones permiten efectuar una diferenciación presuntiva entre la mayoría de las especies de vibrio, Aeromonas, Plesiomonas shigella y otras bacterias.

b.- Caldo triptona al 3% de NaCl (T1N3).

Inocular las colonias en los caldos T1N0 y T1N3 e incubar durante 18 a 24 horas de 35-37ºC. El V. cholerae y el V. mimicus crecerán en T1N0 y T1N3. Algunas especies de bacterias que no son vibrios y que presentan reacciones similares a las de V. cholerae en medios de TSI y LIA no crecen en T1N3. La mayoría de las especies vibrio spp, incluyen algunos V. cholerae No. 01, crecerán en T1N3 únicamente de la familia vibrionaceae crece solamente en T1N3.

Una alternativa consiste en usar agar gelatina (GA) y agar gelatina con 3% de NaCl (GS) para determinar la tolerancia de los cultivos puros a la sal. Dividir las placas en ocho sectores, inocular una línea recta en el centro de un sector de las placas, tanto de GA como de GS con cada cultivo puro. Incubar durante 18 a 24 horas de 35-37ºC. El V. cholerae y el V. mimicus crecerán. El vibrio spp halofílico crecerá en ambas placas, porque ellos no requieren de sal. Sólo en la placa con GS. Para leer la reacción de la gelatinasa sostener la placa sobre una superficie negra, observará un halo opaco alrededor de la colonia de los microorganismos gelatinasa positivos.

c.- Caldo glucosa de Hugh-Leifson.

Inocular colonias individuales en tubos duplicados con caldo de glucosa de Hugh-Leifson. Recubrir un tubo con una capa de aceite mineral estéril o vapor líquido (50% de petrolato y 50% de parafina) unos dos centímetros de grueso. Incubar ambos tubos durante 18 a 24 horas de 35-37ºC. Las especies de Vibrio spp utilizan la glucosa tanto para la oxidación como para la fermentación. Las especies de pseudomonas, que comúnmente se aíslan del pescado y los mariscos con métodos de enriquecimiento que se usan para las especies de vibrio, utilizan la glucosa sólo para la oxidación.

d.- Prueba de oxidasa.

Realizar la prueba de oxidasa con cultivos puros de agar soya tripticasa (2% de NaCl) u otro medio que no contenga carbohidratos fermentables. Un método fácil consiste en colocar un círculo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerlo con algunas gotas de reactivo de oxidasa. Con un palito aplicador de madera, un mondadientes o una asa de platino estéril, sacar un poco de cultivo de la placa y tocar el papel humedecido, si hay microorganismos oxidasa positivos, el papel se tornará púrpura oscura o azul en pocos segundos. Las especies patógenas de vibrio son oxidasa positivas (excepto el V. metschnnikovii).

3. Identificación y confirmación de V.chloreae 01, V.cholerae NO 01 y V. mimicus.

a.- Leer los resultados de las prueba bioquímicas de TSI, KIA, AGS, T1N0 y T1N3 o GA y GS, y caldo glucosa de Hugh-Leifson.

b.- Hacer una tinción de Gram a un cultivo de 18 a 24 horas en caldo o agar.

Nota: Los cultivos puros que se someterán a las demás pruebas serológicas y bioquímicas para el V. cholerae son sacarosa positivos (amarillo) en agar TCBS y sacarosa negativos (verdes) en el caso de V. mimicus o son celobiosa negativos (verde-púrpura) en agar mCPC, crecen en caldo T1N0 o en placas con GA; presentan reacciones características en TSI, KIA y AGS. Son gelatina y oxidasa positivos, son bacilos curvos gram negativos y producen ácido a partir de la glucosa, tanto en la oxidación como en la fermentación, en el caldo de cultivo de Hugh-Leifson.

c.- Pruebas bioquímicas.

Las reacciones bioquímicas para identificación de V. cholerae y otras especies bacterianas afines figuran en el cuadro anexo. La fórmula para todos los medios bioquímicos deberá contener por lo menos un 2% de NaCl. En vez de medios convencionales se pueden usar tiras AP120E, con 2% de NaCl como diluyente. Para el V. cholerae se puede usar solución salina fisiológica (0,85% de NaCl) como diluyente.

d.- Prueba serológica de aglutinación.

Usar antisuero de diagnóstico del grupo 01 y del subgrupo Inaba (factores AC) y Ogawa (Factores AB) para el antígeno del serotipo 01. Usar cultivos de 16 a 24 horas producidos en TSA. Incluir cultivos positivos y negativos, y los controles salinos para cada antisuero usado. Seguir las instrucciones del antisuero. Como es posible que los antígenos de los antisueros estén relacionados entre sí, hay que realizar pruebas bioquímicas para confirmar que el cultivo puro sea de V. cholerae 01 o No. 01.

Nota: Anticuerpos monoclonales están disponibles, pero el anti-B y anti-C reaccionan opuestamente con bacterias de otras especies. Uso de anticuerpos policlonales y/o monoclonales será para el antígeno del complejo 01

1.- Los cultivos que aglutinan con el antisuero del grupo 01, pero no en solución salina fisiológica simple, son de V. cholerae del grupo 01 si las reacciones bioquímicas confirman que el cultivo puro es de V. cholerae. Los cultivos que se aglutinan con este antisuero para grupos específicos pueden ser clasificados según el subtipo con anticuerpos Inaba y Ogawa.

- Los cultivos que aglutinan con el suero polivalente (grupo 01) y con los antisueros Inaba y Ogawa, tienen los 3 factores (A, B y C) y son del serotipo Hikojima.

- Los cultivos que aglutinan con el antisuero polivalente, pero no aglutinan con antisueros Inaba y Ogawa, no se pueden tipificar con estos antisueros.

2.- Los cultivos de V. cholerae cuya identidad se haya confirmado con métodos bioquímicos y que no aglutinen con el antisuero del grupo 01 son V. cholerae 0:1. El suero para la clasificación de V. cholerae No 0:1 según el tipo se puede obtener de R.J. Siebeling.

3.- Los cultivos que se aglutinan en el antisuero del grupo 01 y en solución salina, no se pueden clasificar según el tipo. Sin embargo, si se usa un medio más rico, como en TSA o agar infusión cerebro corazón (BHI), se puede eliminar esta autoaglutinación.

e. Características mínimas para la identificación de V. cholerae.

Las características que permiten suponer la presencia de V. cholerae como mínimo son las siguientes:

1.- Morfología.

Bacilo o bacilo encorvado, esporogénico y gram negativo.

2.- Aspecto en TSI.

Estría ácido, picadura ácido, gas negativo y H2S negativo.

3.- Prueba de Hugh-Leifson.

Fermentación de la glucosa y oxidación positiva.

4.- Citocromo-oxidasa positivo.

5.- Prueba de la dihidrolasa arginina: negativo.

6.- Prueba de la lisinadescarboxilasa: positivo.

7.- Prueba de VP: Positivo El Tor, negativo Clásico y V. mimicus.

8.- Crecimiento a 42ºC: positivo.

9.- Prueba de halofilia con NaCl.

0%: positivo, 3%: positivo, 6%: usualmente negativo. Algunas cepas de V. cholerae NO 01 se desarrollan a 0% de NaCl.

10.- Fermentación de la sacarosa: positivo para V. cholerae (negativo para V. mimicus).

11.- Prueba de ONPG: positivo.

12.- Fermentación de la arabinosa: negativo.

13.- 0/129 sensitiva: sensible para 10 y 150 µg 0/129

REACCIONES DE ALGUNOS Vibrio EN AGAR KIA, TSI Y AGS.

Micro

organis KIA TSI AGS

mos Estría Picadura Estría Picadura Estría Picadura

V.cholerae K A A(K)* A K a

V.mimicus K A K(A)* A K A

V.parahe-molyticus K A K A K A

V.algino lyticus K A A A K A

V.vulnificus K o A A K(A)* A K A

V.hidrophyla K o A A K o A A K K

V.shigelloides K o A A K o A A N N

* = Raramente

K = Alcalino

A = Acido

a = Ligeramente ácido

N = Neutro

Ninguna de las especies de vibrio enumeradas produce sulfuro de hidrógeno en medios KIA, TSI o AGS, ni una cantidad perceptible de gas a partir de glucosa en medios KIA, TSI o AGS. Algunas especies de Aeromonas pueden producir gas a partir de glucosa en estos medios.

3. Método de Determinación de Acido Domoico

3.1 Material y reactivos:

- Tubos de centrífuga

- Agua destilada

- Membranas

- Triptófano

- Metanol

3.2 Preparación de la muestra:

3.2.1 Pesar 5 g de la muestra dentro del tubo de la centrífuga.

3.2.2 Agregar 5 ml de agua destilada y mezclar.

3.2.3 Agregar 10 ml de metanol y mezclar. Ajustar el volumen a 20 ml con metanol de ser necesario.

3.2.4 Centrifugar a 3,000 rpm aproximadamente por 5 minutos.

3.2.5 Diluir 1 ml del sedimento en 25 ml de agua destilada. Las alícuotas y diluciones pueden ser ajustadas por debajo de los niveles de ácido domoico. Se ha encontrado que esta dilución puede establecerse a una cantidad de 1 mg/kg de ácido domoico aproximadamente.

3.2.6 Filtrar en una membrana la muestra y analizarla por HPLC, de acuerdo a los requisitos del método del AOAC (suplemento 2,991.26)

3.2.7 De acuerdo al HPLC, se inyectará a la mezcla ácido domoico y triptófano (en proporción de 1:10 µg/ml respectivamente), observando la separación adecuada entre estos dos componentes.

La inadecuada separación entre estas sustancias significa resultados positivos falsos de ácido domoico.

Fecha de publicación: 6 de marzo de 1995

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